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关于液相色谱实验技术问题解答
点击次数:1340 发布时间:2015-06-17

 
  1、液相色谱是如何实现、快速、灵敏的?
 
  解:气相色谱理论和技术上的成就为液相色谱的发展创造条件,从它的、高速和高灵敏渡得到启发,采用5一10四微粒出定相以提高柱效,采用高压泵加快液体流动相的流速;设计高灵敏度、死体积小的紫外、荧光等检测器,提高检测灵敏度,克服经典液相色谱曲缺点,从而达到、快速、灵敏。
 
  2、与气相色谱法相比液相色谱有哪些优点和不足?
 
  解:气相色谱的分析对象是在校温下具有一定的挥发性、对热稳定购物质。因此它只限于分析气体和沸点低的化合物或挥发性的衍生物。而液相色谱由于以液体作为流动相,只要被分析的物质在选用的流动相中有一定的按解度,便可以分析,所以适用性广,不受样品挥发性和热稳定性的限制,特别适合于那些沸点高、极性强、热稳定性差的化合物,例如,生化物质和药物、离子型化合物、热稳定性差的天然产物等。在目前已知的有机化台物中,
 
  只有20%样品可不经化学处理而能满意地用气相色谱分离,80%的有机化合物要用液相色谱分析。
 
  气相色谱中流动相是惰性的,它对组分没有作用力,仅起运载作用、而液相色谱的流动相不仅起运载作用,而且流动相对组分有一定亲合力,可以通过改变流动相种类和组成提高分离的选择性,另外可作流动相的化合物多,选择余地广。
 
  与气相色谱相比,液相色谱的另一个优点是样品的回收比较容易,只要开口容器放在柱子末端,就可以很容易地将所分离的各组分收集。回收是定量的,可以用来提纯和制备具有足够纯度的单一物质。
 
  液相色谱不足的是,日前检测器的灵敏度不及气相色谱。必须特别注意“柱外效应”对柱效率及色谱分离的影响。
 
  3、试比较气相色谱与液相色谱的H-u曲线,分析产生不同的原因。
 
  解:从图可看出,气相色谱和液相色谱得到的H-u曲线,形状迥然不同,流动相的流速对柱效的影响也不一样,在气相色谱的H-u曲线上,塔板高度H随u变化呈双曲线.曲线有一zui低点,这时柱效zui高,板高zui小,流速*。而液相色谱H-u曲线,未出现流速降低板高增加的现象,由于*流速趋近于零,一般观察不到zui低板高相对应的*流速。在正常的情况下,流速降低,板高H总是降低的,这与气相色谱明显不同。在气相色谱中流动相流速增大,柱效呈直线降低,而在液相色谱中,流动相流速增大,柱效平缓降低。其主要原因是液相色谱的流动相为液体,液相的扩散系数Dm很小,通常仅为气相扩散系数的104~105分之一,所以分子扩散项在低u时也不起多大作用、因此液相色谱H-u曲线未能出现流速降低,板高增加现象。到高速时,虽然柱内线速提高,但固定相和流动相的传质都能很快进行,故H-u曲线上升缓慢。
 
  4、简述液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素,如何减少谙带扩张、提高柱效?
 
  解:液相色谱中引起色诺峰扩展的主要因素为涡流扩散、流动相传质、停留流动相传质及柱外效应。
 
  在液相色谱中要减小谱带扩张,提高柱效,要减少续料颗粒直径,减小境料孔穴深度,提高装填的均匀性,采用低粘度溶剂作流动相,流速尽可能低,同时要尽可能采用死体积较小的进样器、检测器、接头和传输管线等。
 
  5、为什么要提出折合参数?有何特点?
 
  解:我们知道色谱操作条件对板高是有影响的.Giddings发现,固定相相同,填充良好,共是粒度dp不同,因而H-u曲线不同,在液相色谱中,培板高度是粒度的函数,为了比较不向色谱条件下的板高H.提出折合参数,包括折合板高、折合流速、折合柱长。其特点是对于不同粒度的填料能得到相同的H—ur 曲线,因此可以在相同的条件下比较不同填料的柱效。
 
  6、色谱柱A长度为15cm,载体粒度为5m.另一B柱长为30cm,载体粒度为10m,两柱的柱效相等吗?
 
  解:A柱的折合柱长为30000,B柱的折合柱长也为30000,表明组分在两根柱内从柱人口到出口都经过30000个载体颗粒.两校的柱效相等。
 
  7、何谓梯度淋洗,适用于哪些样品的分析?与程序升温有什么不同?
 
  解:梯度淋洗就是在分离过程中.让流动相的组成、极性、pH值等按‘定程序连续变化。使样品中各组分能在*的k下出峰。使保留时间短、拥挤不堪、甚至重叠的组分,保留时间过长而峰形扁平的组分获得很好的分离,特别适合样品中组分的k值范围很宽的复杂样品的分析。梯度淋洗十分类似气相色谱的程序升温,两者的目的相同。不同的是程序升温是通过程序改变柱温。而液相色谱是通过改变流动相组成、极性、pH值来达到改变k的目的。
 
  8、流动相为什么要预先脱气?常用的脱气方法有哪几种?
 
  解:流动相中溶解气体存在以下几个方面的害处,气泡进入检测器,引起光吸收成电信号的变化,基线突然跳动,干扰检测;溶解在溶剂中的气体进入色谱柱时,可能与流动相或固定相发生化学反应;溶解气体还会引起某些样品的氧化降解.对分离和分析结果带来误差。因此,使用前必须进行脱气处理。常用的脱气法有以下几种:(1)加热脱气法;(2)抽吸脱气法;(3)吹氦脱气法;(4)超声波振荡脱气法。
 
  9、按固定相孔径大小分类,液相色谱固定相有哪几类?各有什么特性及适用范围?
 
  解:从固定相的孔隙深度考虑,液相色谱固定相分为表面多孔型(薄壳型)和全多孔型(全孔型)两类。
 
  表面多孔型固定相多孔层厚度小.孔浅,相对死体积小,出峰迅速,柱效高,颗粒较大,渗透性好,由于孔浅,梯度淋洗时,当流动相成分改变后.孔内外流动相成分能迅速达到平衡,机械强度高,装柱容易,其不足的是由于多孔层厚度小,因而柱容量小,zui大允许样品量受到限制,适用于比较简单的样品分析及快速分析。
 
  全多孔型固定相,由于颗粒很细,孔仍然很浅.传质速度较快,柱效高。梯度淋洗时孔内外流动相成分的平衡速度仍然较快.其zui大特点是柱容量大,zui大允许样品量是表面多孔型的5倍,但装填的什于渗透性低,因而需要更高的操作压力.制柱比表面多孔型的难。这种固定相特别有利于痕量组分及多组分复杂混合物的分离分析。
 
  10、什么叫化学键合色谱? 与液—液色谱相比有何优点?
 
  解:通过化学反应,将固定液键合到载体表面,此种固定相称为化学键合固定相;采用化学键合固定相的色谱法,称为化学键合色谱。
 
  与液—液分配色谱相比,键合色谱法的主要优点:(1)化学键合固定相非常稳定,在使用过程中不流失。(2)适宜用梯度淋洗。(3)适合于k范围很宽的样品。(4)由于键合到载体表面官能团,既可是非极性的,也可是极性的,因此应用面广。
 
  11、(选择题)在液相色谱中,常用作固定相合相基体的物质是
 
  A.分子筛 B.硅胶 c氧化铝 D.活性炭
 
  解:B.硅胶。
 
  要形成化学键合固定相,所用的基质材料应有某种化学反应活性,在四种固体固定相中只有硅胶合有硅醇基,是能进行键合的活性官能团。
 
  12、液相色谱柱有哪几种类型? 细径柱有什么优点?
 
  解:液相色谱拄大致可分为三种类型:内径小于2mm的称为细管径或微管径柱;内径在2~5mm范围内的是常规液相色谱柱;内径大于5mm的一般称为半制备柱或制备柱。细管径柱的主要优点是:(1)分离效能高。(2)流动相*流速低,消耗量少。(3)可采用多种检测器,便于联用(CLC MS,CLC-FTIR)。(4)采用细而短的毛细管柱可以提高分析速度,实现快速分析。
 
  13、什么叫反相色谱?试从固定相、流动相、流出次序、流动相极性的影响等几个方面比较正相和反相的区别。
 
  解:流动相的极性比固定相的极性强的色谱体系叫反相色谱。例如以十八烷基硅胶键合相(ODS)为固定相,以甲酵/水作流动相,是典型的反相色谱。正相色谱和反相色谱这两种操作模式的主要区别见下表:
 
  正相和反相色谱的区别
 
  比较项目正相色谱反相色谱
 
  固定相
 
  流动相
 
  流出次序
 
  流动相极性的影响极性
 
  非(弱)极性
 
  极性组分k大
 
  极性增加,k减小非(弱)极性
 
  极性
 
  极性组分k小
 
  极性增加,k增大
 
  14、对液相色谱流动相有何要求?
 
  解:用作液相色谱流动相的溶剂,其纯度和化学特性必须满足色谱过程中稳定性和重复性的要求。对样品要有一定的溶解能力,粘度小,化学稳定性好,避免发生不可逆的化学吸附。溶剂应与检测器相匹配,不干涉所使用检测器的工作,制备色谱的溶剂应不干扰对分离各组分的回收。除此以外,选择的溶剂对所给定的样品组分具有合适的极性和良好的选择性。
 
  15、在150×2mm硅胶柱流动相为已烷/甲醇(150:2),紫外检测器色谱条件下分离丙烯酰胺,判断以下组分的出峰次序,为什么?
 
  解:在给定的色谱条件下,组分B先出峰,组分A后出峰。以硅胶为固定相,己烷/甲醇(150:2)为流动相,该体系为正相色谱,样品的极性A>B,在正相色谱体系极性小的组分先出峰,极性大的组分后出峰,所以出峰次序为B先出,A后出。
 
  16、在硅胶往上,用甲苯为流动相,某组分的保留时间为30min,如果改用四氯化碳或乙醚为流动相,试指出选用哪一种溶剂能减少该组分的保留时间? 为什么?
 
  解:该体系为正向色谱体系。在该体系中流动相的极性增大保留值减小。流动相甲苯、四氯化碳及乙醚的溶剂强度参数分别是0.29、0.18、0.38,因此选用溶剂强度参数大于甲苯的乙醚,可缩短该化合物的保留时间。
 
  17、在液相色谱中,组分和溶剂分子之间存在哪几种作用力?
 
  解:存在色散力、偶极作用、氢键作用和介电作用等四种作用力。
 
  18、什么是溶剂极性参数与溶剂强度? 它们之间的关系如何?
 
  解:溶剂分子与溶质分子以色散力、偶极作用力、氢键作用力及介电作用力四种方式进行相互作用的能力称为分子的“极性”,溶剂的这种能力以溶剂极性参数P’表示,P’值越大,溶剂的极性越强。
 
  溶剂强度指用作流动相的溶剂,将组分从色谱柱上洗脱下来的能力。
 
  溶剂强度直接与溶剂的极性有关,而且随不同色谱体系而变,在正相色谱体系中,溶剂极性增加,使组分从柱上洗脱下来的能力增加,即P’越大的溶剂,溶剂强度越大。在反相色谱中,溶剂极性减小,使组分从柱上洗脱下来的能力增加,即P’越小的溶剂,溶剂强度越大。
 
  19、预测在正相色谱与反相色谱体系中,组分的出峰次序。
 
  解:在正相色谱体系中组分的出峰次序为:极性弱的组分,在流动相中溶解度较大,因此k值小,先出峰。极性强的组分,在固定相中的溶解度较大,因此k值大,后出峰。
 
  在反相色谱中组分的出峰次序为:极性弱的组分在固定相上的溶解度大,k值大,后出峰,相反极性强的组分在流动相中溶解度大,k值小,所以先出峰。
 
  20、在ODS固定相上,以甲醇为流动相,某组分的分配容量k1=1.2,如以乙腈为流动相,其k增加还是减少? 为什么?
 
  解:据题意为反相色谱体系。
 
  k值增加,在反相色谱体系中,流动相由甲醇变为乙腈,溶剂极性参数由5.1变为5.8,增加了,但组分在流动相中的溶解度反而减小,所以k值增大。由1.2增大为2.24。
 
  21、在反相色谱中,流动相从40%(V/V)甲醇—水改变为60%(V/V)甲醇—水,问组分的调整保留值将改变多少? 为什么? (P’ 甲醇=5.1,P’ 水=5.1)
 
  提示:对于由溶剂A和B组成的二元混合溶剂,其极性可表示为
 
  Pab ‘=a P a’ b P b’
 
  式中a和b分别为溶剂A和B在混合溶剂中的分数。
 
  解:在40%配比时,混合溶剂的极性为
 
  P1’ =0.46×5.1 0.6×10.2=8.16
 
  在60%配比时,混合溶剂的极性为
 
  P2’ =0.6×5.1 0.4×10.2=7.14
 
  P2’= P2’- P2’=7.14-8.16= -1.02
 
  根据反相色谱体系
 
  ∴在反相色谱中,流动相的极性变弱(P’由8.16变为7.14),溶剂强度增加,洗脱能力增加,因而使组分的调整保留时间减少到原来的1/3.2。
 
  22、某色谱体系采用25%三氯甲烷/正己烷为流动相,发现组分分离不十分理想,想通过改变流动相的选择性来改善分离选择性,选用乙醚/正己烷为流动相,问乙醚/正己烷的比例为多少? (P’ CHCl3=5.1,P’乙醚=5.1)
 
  提示:流动相选择性的改变是通过保持溶剂强度不变时改变流动相组成来实现的,改变前流动相A/B和改变后的流动相A/C的组成有下列关系:
 
  解:25%的CHCl3/正己烷与37%乙醚/正己烷的溶剂强度相等,但对样品的分离选锋性不同。
 
  23、什么叫离子色谱?
 
  解:在低交换容量的分离柱上,分离样品离子,而在高交换容量的抑制柱上,通过化学反应,把具有高电导的流动相转变为低电导的流动相,这样就可以在电导检测器上对被分离样品离子进行高灵敏度的检测。这种采用分离柱、抑制柱和电导检测器相结合的离子交换色谱称为离子色谱。
 
  24、为什么凝胶色谱中任何组分的分配系数必须符合0≤K≤1?如果K>l说明什么问题?
 
  解:因为组分的分配系数为K=Cs/Cm ,C s与Cm分别为组分在固定相和流动相中的浓度,当分子直径大于固定相孔径时,此时Cm=0,∴K=0。当分子直径小于孔径时,组分向孔隙内流动相扩散,达到平衡时,一半组分在孔隙内,一半在孔隙外,此时K=1.0,若分子直径介于以上两种极限情况之间,K一定介于0与1之间.可见在凝胶色谱中,任何组分的分配系数为0≤K≤1,如果K>1,这说明此时的分离方式已不是纯粹的凝胶色谱,其分离过程受到其他作用力(如吸附)的支配。
 
  25、某人用凝胶色谱分离一高聚物样品,分离情况很差,他改变流动相的组成后,分离情况大为改进,这种说法对吗? 为什么?
 
  解:这种说法不对。在凝胶色谱中流动相只起运载的作用,不能依靠改变流动相的性质和组成来改善色谱体系的选择性。凝胶色谱的选择性只能通过选择合适的固定相,根据固定相孔隙的大小以及孔径分布范围的*化来实现。题目中“改变流动相组成后,分离情况大为改进”是不可能的。
 
  26、(选择题)液相色谱中通用型检测器是
 
  A.紫外吸收检测器 B.示差折光检测器 C热导池检测器 D.荧光检测器
 
  解:B.示差折光检测器。
 
  A、D为选择性检测器,C为气相色谱中通用检测器。
 
  27、为了测定邻氨基苯酚中微量杂质苯氨,现有下列固定相:硅胶、ODS键合相,下列流动相:水—甲醇、异丙醚—己烷,应选用哪种固定相、流动相? 为什么?
 
  解:邻氨基苯酚中微量杂质苯氨测定,为了良好分离,应让苯氨先出峰,由于苯氨的极性小于邻氨基苯酚,因此应采用正相色谱法,应选硅胶为固定相,异丙醚—己烷为流动相。
 
  28、在ODS键合固定相,甲醇—水为流动相时试判断四种苯并二氮杂苯的出峰顺序。为什么?
 
  解:色谱条件为反相键合色谱体系,在反相色谱体系中极性大的组分k小,首先出峰,按四种苯并二氮杂苯的结构,出蜂顺序为4—3—2—1。
 
  29、用多孔凝胶为固定相,流动相为四氢呋喃,分离以下各组分,试判断各组分的出蜂顺序。为什么?
 
  解:凝胶色谱组分的出峰次序是根据分子尺寸大小,大的先出峰.故出峰次数为n=9、8、7。
 
  30、分离含胺类和季铵接的样品,以0.2M HClO4溶液为固定相,以丁醇—二氯甲烷—己烷为流动相,已知组分A的保留时间为8.2min,死时间为1.0min.在另一根柱上.其他条件均不改变,只将HClO4的浓度增加一倍,间组分A在第二根柱上的移动速率,是在*根柱上的几倍?
 
  解:从题意分析知,该题分离类型是正相离子对色谱,因此K与KBP的关系为:
 
  A在第二根柱上的移动速率是*根柱的1.78倍。
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